COVID-19 – Cos’è il CT value e come si correla con l’infettività?

di Antonino Napoleone, Giuseppe Scarlata | 24 Marzo 2022.

Nonostante sia diventata una pratica comune, il test diagnostici per il Covid-19, celano delle peculiarità tecniche che non sono ben note a tutti. Come già descritto in precedenti articoli (leggi anche COVID-19 opzioni di test diagnostici), ci sono diverse tipologie di test, tuttavia i test molecolari rappresentano il gold standard nella diagnostica delle infezioni da SARS-CoV-2. Al contrario dei test rapidi, dove il risultato è visibile in soli 15 minuti e comodamente da casa, nei test molecolari è necessario ricorrere ad un team di ricercatori e tecnici di laboratorio specializzati. Infatti, in questo caso è cruciale saper analizzare correttamente i campioni ed infine interpretare i risultati finali. Come si leggono i risultati dei test molecolari per la diagnosi di SARS-CoV-2? Come si misura la carica virale? Si può stimare la gravità dell’infezione? Scopriamo insieme come vengono effettuati i test molecolari in laboratorio!

Test molecolare

Il test molecolare si basa su una tecnologia avanzata chiamata RT-PCR (reverse transcriptase-Polymerase Chain Reaction), che è in grado di identificare con elevata precisione la presenza di materiale genetico del virus nel campione prelevato tramite tampone nasofaringeo. Quando si parla di materiale genetico, ci si riferisce al genoma o acido nucleico che può essere costituito da DNA o RNA, e come abbiamo appreso negli ultimi anni, il Coronavirus ha un genoma costituito da RNA. Questa tecnologia sfrutta un processo biochimico attraverso il quale viene identificato il target genetico del virus attraverso degli “inneschi” specifici chiamati primers, che sono unici per la sequenza del virus. Infatti, il più grande vantaggio di questa tecnica consiste proprio nella capacità di riuscire a rilevare anche una minima presenza del patogeno a RNA nel campione, in un lasso di tempo che varia da 1 a 3 ore. Per questo motivo la scoperta e l’impiego della RT-PCR nei laboratori biomedici, ha rivoluzionato il mondo della ricerca e della diagnostica.

Quindi i più grandi vantaggi di questa tecnologia sono:

• la specificità, cioè l’elevata capacità di rilevare esclusivamente un target specifico, con rischi di praticamente assenti di cross-contaminazioni (cioè RNA o DNA di altri microorganismi diversi).
• La sensibilità, cioè l’abilità di rilevare anche minime quantità di DNA o RNA all’interno di un campione biologico.

Come si effettua una RT-PCR?

In un nostro precedente articolo abbiamo percorso il viaggio del campione biologico per la rilevazione di SARS-CoV-2, dalla prelevazione tramite tampone nasofaringeo fino alla validazione dei risultati (leggi anche: Dal campione al referto). Ma come si effettua un test molecolare? Dopo avere effettuato il tampone, Il campione biologico viene pretrattato e purificato per poi essere preparato per la reazione di RT-PCR (figura 2).

La reazione comprende un mix di reagenti preparati in laboratorio:

• Primers, menzionati prima, che servono proprio da innesco per la reazione.
• Enzimi, chiamati polimerasi, che riconoscono gli “inneschi” e svolgono la reazione biochimica chiave del test molecolare.
• Basi nucleotidiche, che costituiscono i mattoncini di DNA utilizzati dagli enzimi durante la reazione biochimica.  
• Sonde fluorescenti, che sono in grado emettere un segnale luminoso quando rilevano e si legano al prodotto della reazione biochimica sintetizzato dagli enzimi.

Il principio della reazione si basa fondamentalmente su quattro fasi:

1. I primers agiscono riconoscendo e attaccandosi in modo specifico ad una sequenza target del genoma del virus.
2. Gli enzimi riconoscono gli inneschi e avviano una reazione biochimica utilizzando le basi nucleotidiche, per avviare la sintesi di un prodotto finale.
3. Se la sequenza del virus è presente, gli enzimi sintetizzano un prodotto finale a cui le sonde fluorescenti si legano, emettendo un segnale luminoso rilevabile dallo strumento.
4. La reazione biochimica avviene in condizioni di cicli e consiste in una fase di sintesi e di amplificazione del prodotto finale. Se il target virale è presente, la reazione ha luogo e per ogni ciclo il prodotto finale viene amplificato in modo esponenziale fino a raggiungere un plateau in cui la reazione si satura e non procede oltre (Figura 2).

Al contrario, se il virus non è presente, la reazione non avrà luogo e il risultato del test sarà negativo. 

Che cos’è il Ct value nei test molecolari?

Alla fine del test molecolare, i risultati sono indicati dal valore chiamato Ct value. Il cycle threshold (Ct) value o valore di cicli di soglia corrisponde esattamente al numero di cicli di amplificazione necessari affinché la reazione biochimica della RT-PCR produca un segnale luminoso di positività al virus che superi il valore di soglia minimo (cycle threshhold).  Come descritto prima, una concentrazione elevata di materiale genetico del virus nel campione, sarà rilevata con un valore minimo di Ct value (<26), mentre al contrario, concentrazioni basse di virus richiederanno più cicli per essere rilevate, quindi si avrà un Ct value maggiore (>32). In generale, in un test molecolare di RT-PCR si ha una soglia minima di 20-22 cicli una massima di 40 cicli. Il Ct value è quindi un indicatore indiretto della carica virale durante il decorso dell’infezione (Figura 4):

• Un Ct value minore indica una carica virale elevata e maggiore infettività.
• Un Ct value maggiore indica una carica virale bassa e minore infettività.

Conclusioni

Come si traducono questi valori durante il decorso dell’infezione? Valori bassi di Ct value (carica virale alta) possono indicare una maggiore probabilità di sviluppare una marcata sintomatologia e di trasmettere il virus. Valori alti di Ct value possono essere attribuiti a diversi scenari clinici, come un caso d’infezione asintomatica, l’effetto protettivo della vaccinazione contro SARS-CoV-2, oppure una fase di convalescenza, dove il rischio di infettività risulta minore (leggi anche: COVID-19 e vaccini: si può frenare la trasmissione del virus?). Questo valore ha una grande valenza dal punto di vista clinico e diagnostico, poiché offre un notevole supporto tecnico-scientifico nella gestione e monitoraggio dei pazienti positivi all’infezione da SARS-CoV-2. Anche in questo caso è evidente quanto sia importante tener conto e fidarsi del parere scientifico nella prospettiva di una gestione della pandemia ponderata e allo stesso tempo risolutiva. Per cui deve essere ancora più forte il messaggio di condividere la fiducia nelle scienze mediche e non mediatiche!

Bibliografia

• https://www.iaea.org/bulletin/how-is-the-covid-19-virus-detected-using-real-time-rt-pcr
• Understanding cycle threshold (Ct) in SARS-CoV-2 RT-PCR (publishing.service.gov.uk)
• Wikramaratna PS, Paton RS, Ghafari M, Lourenço J. Estimating the false-negative test probability of SARS-CoV-2 by RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(50):2000568. doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.50.2000568.
• Lan L, Xu D, Ye G, et al. Positive RT-PCR Test Results in Patients Recovered From COVID-19. JAMA. 2020;323(15):1502–1503. doi:10.1001/jama.2020.2783.